摘要：采用液相沉積法在棉花纖維的表面成功沉積了納米氧化鋯顆粒，并將其裝填在移液槍的吸頭內(nèi)，通過移液槍的抽吸實(shí)現(xiàn)對磷酸化多肽的萃取，萃取過程只需要2ｍｉｎ，方法簡單、快速。該材料不僅可以從β-酪蛋白酶解物這種簡單的體系中萃取出9個磷酸化多肽，還可以從物質(zhì)的量比為1:100的β-酪蛋白酶解物和牛血清白蛋白（ＢＳＡ）酶解物混合物這類含有大量非磷酸化多肽的復(fù)雜樣品中萃取出4種磷酸化多肽，且沒有非磷酸化多肽被檢出，表現(xiàn)出較好的萃取選擇性。將該材料應(yīng)用于人血清和脫脂牛奶這兩種復(fù)雜實(shí)際樣品的酶解物中磷酸化多肽的快速富集萃取，分別檢測出5種和9種磷酸化多肽，均表現(xiàn)出較好的選擇性。
關(guān)鍵詞：氧化鋯,納米材料,液相沉積法,磷酸化多肽,富集
蛋白質(zhì)的磷酸化是一種重要的可逆性翻譯后修飾，參與諸多生理調(diào)控過程［1］。一般采用電噴霧質(zhì)譜（ＥＳＩ-ＭＳ）或基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜（ＭＡＬＤＩ-ＭＳ）對磷酸化蛋白的酶解產(chǎn)物進(jìn)行檢測，用于研究磷酸化的豐度、位點(diǎn)等。但是，由于磷酸化多肽在體內(nèi)含量低，且所處基質(zhì)復(fù)雜，難以直接進(jìn)行質(zhì)譜分析檢測。因此，在質(zhì)譜分析前，需對其進(jìn)行純化和富集［2，3］。目前應(yīng)用最廣泛的磷酸化多肽的富集方法主要是固載金屬親和色譜法［4-9］和金屬氧化物親和色譜法［10-15］。其中，金屬氧化物親和色譜法中已有多種金屬氧化物（如ＴｉＯ2、ＺｒＯ2、Ａｌ2Ｏ3等）被開發(fā)應(yīng)用于磷酸化多肽的富集，但是由于金屬氧化物表面性質(zhì)的差異，它們對磷酸化多肽的選擇性存在較大的差別［16，17］，如ＺｒＯ2和ＴｉＯ2，Ｚｒ和Ｔｉ在晶體中的配位數(shù)不同會導(dǎo)致它們對磷酸化多肽不一樣的結(jié)合能力；不僅如此，采用不同方法制備得到的不同晶型的同種類型金屬氧化物對磷酸化多肽也會有不同的選擇性［18］。因此，磷酸化多肽預(yù)富集新方法及富集材料的開發(fā)一直是磷酸化蛋白質(zhì)組研究的重要課題，具有重要意義。
同時(shí)加入它們的反應(yīng)產(chǎn)物ＨＦ的消耗劑硼酸（Ｈ3ＢＯ3）或金屬鋁使金屬氧化物薄膜沉積在基質(zhì)表面。該方法操作簡單、不受基底形狀限制、制備過程中不需要熱處理，并且不需要昂貴的設(shè)備，它是專為制備氧化物薄膜而發(fā)展起來的，因此被廣泛應(yīng)用于催化材料或電極材料等材料中功能性氧化物薄膜的制備。
基于ＬＰＤ的特點(diǎn)，本課題組將該方法應(yīng)用于分離介質(zhì)材料的制備中［11，14，20-23］，目前我們已采用ＬＰＤ分別在毛細(xì)管和硅膠基質(zhì)上沉積了納米氧化鈦、納米氧化硅及納米氧化鎳等多種納米氧化物涂層材料，目前還未見采用ＬＰＤ制備的納米氧化鋯涂層應(yīng)用于分離科學(xué)領(lǐng)域中的報(bào)道。
棉花作為一種豐富的天然生物材料，具有廉價(jià)、生物相容性好、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，近年來被引入到分離科學(xué)領(lǐng)域，本課題組將進(jìn)行功能化修飾后的棉花應(yīng)用于一種微型化的ＳＰＥ裝置，即將功能化的棉花填裝于注射器內(nèi)或者移液槍的吸頭中，從而對待分析物進(jìn)行快速萃?。?4-29］。因棉花的表面含有大量的羥基，可以作為液相沉積的基底。本工作采用液相沉積法制備了納米氧化鋯沉積棉花纖維（ＺｒＯ2-ＣＦ）材料，對材料進(jìn)行了表征，并將其應(yīng)用于磷酸化多肽的選擇性富集。
1實(shí)驗(yàn)部分
1．1儀器、試劑與材料
冷凍離心濃縮儀（美國Ｌａｂｃｏｎｃｏ公司），掃描電鏡（Ｑｕａｎｔａ200，荷蘭ＦＥＩ公司）及其附帶的能量色散型光譜儀（ＥＤＡＸＧＥＮＳＩＳ，美國Ａｍｅｔｅｋ公司）。ＡｘｉｍａＴＯＦ型ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦＭＳ儀（日本Ｓｈｉ-ｍａｄｚｕ公司）。
磷酸（Ｈ3ＰＯ4）、三氟乙酸（ＴＦＡ）、2，5-二羥基苯甲酸（2，5-ＤＨＢ）、β-酪蛋白（β-ｃａｓｅｉｎ）、牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、碘乙酰胺（ＩＡＡ）、二硫蘇糖醇（ＤＴＴ）、胰蛋白酶等購自美國Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ公司。氟鋯酸（Ｈ2ＺｒＦ6）購自阿拉丁公司。鋁片購自國材科技有限公司。分析純氨水、乙酸購自國藥集團(tuán)有限公司。脫脂棉花購買于徐州衛(wèi)材有限公司。純水使用Ｍｉｌ-ｌｉｐｏｒｅ公司的Ｍｉｌｌｉ-Ｑ裝置（Ｂｅｄｆｏｒｄ，美國）制備得到。脫脂牛奶購于武漢大學(xué)自強(qiáng)超市。血清是來自武漢大學(xué)?？傖t(yī)院健康人的血清，存放在-80℃冰箱中，備用。
1．3樣品的制備
β-酪蛋白酶解物：采用100ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ8.5）緩沖溶液稀釋β-酪蛋白配制1ｇ／Ｌ的β-酪蛋白溶液，然后按照酶與β-酪蛋白質(zhì)量比為1:50的比例在上述溶液中加入胰蛋白酶，將加入了酶的β-酪蛋白溶液在37℃下反應(yīng)16ｈ，β-酪蛋白溶液經(jīng)酶解后得到的產(chǎn)物在真空離心濃縮儀中旋干，存放在-80℃冰箱中備用。
ＢＳＡ酶解物：首先配制含8ｍｏｌ／Ｌ尿素的100ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ8.5）緩沖溶液，然后將1ｍｇＢＳＡ加入到100μＬ上述緩沖溶液中，待ＢＳＡ溶解后，再加入ＤＴＴ（ＤＴＴ終濃度為10ｍｍｏｌ／Ｌ），放于37℃烘箱中反應(yīng)30ｍｉｎ，然后在上述溶液體系中繼續(xù)加入ＩＡＡ（ＩＡＡ終濃度為20ｍｍｏｌ／Ｌ），避光室溫反應(yīng)30ｍｉｎ；之后，再加入300μＬ100ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ8.5）稀釋，按照酶與蛋白質(zhì)質(zhì)量比為1:50的比例加入胰蛋白酶，置于37℃烘箱中反應(yīng)16ｈ。酶解后的產(chǎn)物經(jīng)真空離心濃縮儀旋干后存放于-80℃冰箱中備用。
脫脂牛奶酶解物：將100μＬ脫脂牛奶放在真空離心濃縮儀中旋干，然后加入100μＬ含8ｍｏｌ／Ｌ尿素的100ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ8.5）緩沖溶液復(fù)溶牛奶。剩余的步驟與ＢＳＡ的酶解步驟相同。
1．4磷酸化多肽的富集過程
稱取3ｍｇ的ＺｒＯ2-ＣＦ裝填在200-μＬ吸頭前端，控制材料填裝的高度在4ｍｍ左右，將裝填了ＺｒＯ2-ＣＦ的吸頭裝在移液槍上，通過移液槍的多次吸／推使用。
1．4．1多肽溶液的富集
先將移液槍吸／推20次50μＬ3％（體積分?jǐn)?shù)，下文中若無特殊說明，均為體積分?jǐn)?shù)）ＴＦＡ水溶液-乙腈（50／50，ｖ／ｖ）對材料平衡處理，然后將50μＬ加入了多肽的3％ＴＦＡ水溶液-乙腈（50／50，ｖ／ｖ）上樣液進(jìn)行上樣，為使磷酸化多肽充分吸附在ＺｒＯ2-ＣＦ材料上，吸／推移液槍40次上樣液，然后用50μＬ3％ＴＦＡ水溶液-乙腈（50／50，ｖ／ｖ）清洗兩次，每次吸／推移液槍30次，之后采用50μＬ5％的氨水進(jìn)行解吸兩次，兩次各吸／推移液槍30次。將兩次所得的解吸液合并，真空離心濃縮儀旋干。最后，用2μＬ的基質(zhì)溶液（20ｇ／Ｌ2，5-ＤＨＢ于50％乙腈、1％Ｈ3ＰＯ4的水溶液中）對旋干的解吸液進(jìn)行復(fù)溶，取1μＬ的復(fù)溶液點(diǎn)在質(zhì)譜儀靶上進(jìn)行ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ2ＭＳ分析。
1．4．2血清中磷酸化多肽的富集
與1．4．1節(jié)方法基本一致，先將2μＬ血清樣品用3％ＴＦＡ水溶液-乙腈（50／50，ｖ／ｖ）稀釋至50μＬ，再作為上樣液進(jìn)行上樣，其他操作同1．4．1節(jié)。
1．4．3脫脂牛奶酶解物中磷酸化多肽的富集
將2μＬ脫脂牛奶酶解物用3％ＴＦＡ水溶液-乙腈（50／50，ｖ／ｖ）稀釋500倍，取50μＬ的稀釋液作為上樣液，其他操作同1．4．1節(jié)。
1．5儀器分析條件
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ2ＭＳ分析時(shí)采用波長為337ｎｍ的氮?dú)饧す馄鳎涿}沖寬度為3ｎｓ；采用20ｋＶ的加速電壓，在正離子反射模式下進(jìn)行檢測。質(zhì)荷比（ｍ／ｚ）掃描范圍為1000~3500，每張譜圖是500次激光掃描的平均結(jié)果。
2結(jié)果與討論
2．1ＺｒＯ2-ＣＦ的表征
我們利用掃描電子顯微鏡（ＳＥＭ）對棉花和ＺｒＯ2-ＣＦ的表面形貌進(jìn)行了表征。結(jié)果如圖1所示，相比于棉花（圖1ａ），ＺｒＯ2-ＣＦ的表面出現(xiàn)了一層致密的納米二氧化鋯顆粒（圖1ｂ）。同時(shí)采用能量色散型光譜儀表征了棉花和ＺｒＯ2-ＣＦ表面元素的差異（圖1ｃ，1ｄ），證明了ＺｒＯ2-ＣＦ表面ＺｒＯ2的存在。結(jié)果表明，ＺｒＯ2-ＣＦ中Ｚｒ的含量為5.59％（圖1ｄ）。
2．2ＺｒＯ2-ＣＦ對磷酸化多肽的富集性能考察
2．2．1萃取條件的優(yōu)化
多肽混合物中除含有磷酸化多肽外，還含有大量的非磷酸化多肽，在一定的酸度條件下，含有羧酸根等基團(tuán)的非磷酸化多肽也會與氧化鋯產(chǎn)生路易斯酸堿作用，從而干擾磷酸化多肽的富集，因而需對上樣溶液的酸度進(jìn)行優(yōu)化。我們將ＺｒＯ2-ＣＦ用于β-酪蛋白酶解物和ＢＳＡ酶解物（物質(zhì)的量比為1:10）混合樣品的磷酸化多肽的富集分析研究。上樣液中有機(jī)相為50％乙腈時(shí)，考察水相中不同體積分?jǐn)?shù)的ＴＦＡ對多肽混合物萃取效果的影響。當(dāng)上樣液的水相中ＴＦＡ的體積分?jǐn)?shù)為5％時(shí)，非磷酸化多肽的信號較1％ＴＦＡ和3％ＴＦＡ?xí)r的弱，但信噪比較低；上樣液的水相中ＴＦＡ含量為1％時(shí)，磷酸化多肽的信噪比較高，但是由于溶液的酸度較低，所以羧酸根等離子也被電離，也與納米氧化鋯產(chǎn)生路易斯酸堿作用，因而非磷酸化多肽的信號也較高，綜合比較，最后選擇3％ＴＦＡ水溶液作為上樣液的酸度條件。
仍然將β-酪蛋白酶解物和ＢＳＡ酶解物（物質(zhì)的量比為1:10）混合樣品作為考察對象，固定上樣液的酸度為3％ＴＦＡ，考察上樣液中乙腈含量對萃取效果的影響。如圖2所示，上樣液中含有20％乙腈或者80％乙腈的時(shí)候，解吸液譜圖中都含有大量的非磷酸化多肽（圖2ａ，2ｃ），而上樣液中乙腈的含量為50％時(shí)，解吸液譜圖中的非磷酸化多肽比較少，磷酸化多肽的峰較為明顯（圖2ｂ）。圖中標(biāo)有數(shù)字的峰為磷酸化多肽信號峰，所標(biāo)的數(shù)字為對應(yīng)磷酸化多肽的質(zhì)荷比（ｍ／ｚ）。這可能與磷酸化多肽與大部分非磷酸化多肽的疏水性不同有關(guān)。故選擇50％乙腈作為上樣液的有機(jī)相。
綜上，選擇3％ＴＦＡ水溶液-乙腈（50／50，ｖ／ｖ）作為上樣液。采用填裝了3ｍｇＺｒＯ2-ＣＦ材料的吸頭對3ｐｍｏｌ溶解于3％ＴＦＡ水溶液-乙腈（50／50，ｖ／ｖ）的β-酪蛋白酶解物中磷酸化多肽進(jìn)行萃取，將萃取后的萃余液用ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ2ＭＳ進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)萃余液中無磷酸化多肽信號，表明ＺｒＯ2-ＣＦ對3ｐｍｏｌβ-酪蛋白酶解物中磷酸化多肽萃取沒達(dá)到吸附飽和，滿足少量生物樣品分析。
2．2．2萃取性能的考察
分別采用ＺｒＯ2-ＣＦ和未修飾的棉花纖維ＣＦ對β-酪蛋白酶解物（3ｐｍｏｌ）進(jìn)行萃取分析，考察它們對磷酸化多肽的富集能力。如圖3ａ所示，當(dāng)β-酪蛋白酶解物未經(jīng)材料富集直接進(jìn)行ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ2ＭＳ檢測分析時(shí)，雖然可以檢測到4個磷酸化多肽的信號峰，但是譜圖中還有大量非磷酸化多肽的信號峰，并且檢測到的磷酸化多肽的信號都較弱。而經(jīng)ＺｒＯ2-ＣＦ富集后，萃余液（圖3ｂ）中幾乎看不到磷酸化多肽的峰，表明ＺｒＯ2-ＣＦ材料對磷酸化多肽具有較強(qiáng)的作用，解吸液（圖3ｃ）中可以看到9個磷酸化多肽的峰，幾乎看不到非磷酸化多肽的峰，說明在用ＺｒＯ2-ＣＦ處理后能有效地去除大部分的非磷酸化多肽，表明材料對磷酸化多肽有較好的萃取選擇性。然而用未修飾的棉花富集β-酪蛋白酶解物后的解吸液中只能檢測到1個磷酸化多肽（圖3ｄ），表明ＣＦ表面沉積的納米ＺｒＯ2顆粒對磷酸化多肽具有較好的選擇性作用。
為了進(jìn)一步考察ＺｒＯ2-ＣＦ對磷酸化多肽的萃取選擇性，將它用于β-酪蛋白酶解物和ＢＳＡ酶解物不同比例混合后的磷酸化多肽的富集。如圖4所示，酶解物混合后未經(jīng)富集直接進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)，譜圖中無法觀察到磷酸化多肽的信號（圖4ａ，4ｂ，4ｃ），基本上都是非磷酸化多肽的信號峰，說明非磷酸化多肽嚴(yán)重干擾了磷酸化多肽的質(zhì)譜分析，因此質(zhì)譜檢測磷酸化多肽前需將其選擇性地從復(fù)雜樣品圖5血清酶解物和脫脂牛奶酶解物直接進(jìn)樣和經(jīng)ＺｒＯ2-ＣＦ富集后的ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ2質(zhì)譜圖Ｆｉｇ．5ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ2ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒａｏｆｔｒｙｐｔｉｃｄｉｇｅｓｔｏｆｈｕｍａｎｓｅｒｕｍａｎｄｎｏｎ-ｆａｔｍｉｌｋｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｄｉ-ｒｅｃｔａｎａｌｙｓｉｓｏｒａｆｔｅｒｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅＺｒＯ2-ＣＦａ，ｂ：ｔｒｙｐｔｉｃｄｉｇｅｓｔｏｆｈｕｍａｎｓｅｒｕｍｏｂｔａｉｎｅｄｂｙ（ａ）ｄｉｒｅｃｔａｎａｌｙｓｉｓａｎｄ（ｂ）ａｆｔｅｒｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅＺｒＯ2-ＣＦ；ｃ，ｄ：ｔｒｙｐｔｉｃｄｉｇｅｓｔｏｆｎｏｎ-ｆａｔｍｉｌｋｏｂｔａｉｎｅｄｂｙ（ｃ）ｄｉｒｅｃｔａｎａｌｙｓｉｓａｎｄ（ｄ）ａｆｔｅｒｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅＺｒＯ2-ＣＦ．中萃取出來。圖4ｄ、4ｅ和4ｆ分別為1:1、1:10、1:100（物質(zhì)的量比）的β-酪蛋白和ＢＳＡ酶解物的混合物經(jīng)ＺｒＯ2-ＣＦ富集后質(zhì)譜檢測的譜圖，可以看出，當(dāng)β-酪蛋白酶解物和ＢＳＡ酶解物的比例為1:1時(shí)，經(jīng)材料處理后能觀察到5個磷酸化多肽的信號峰；當(dāng)其混合比例提高到1:10，ＺｒＯ2-ＣＦ富集后的溶液能仍觀察到5個磷酸化多肽的信號峰；而當(dāng)其比例達(dá)到1:100后，ＺｒＯ2-ＣＦ富集后的溶液依然能觀察到4個磷酸化多肽的信號峰，且3個比例的酶解混合物經(jīng)ＺｒＯ2-ＣＦ富集后的質(zhì)譜圖中基本上看不到非磷酸化多肽的峰。以上結(jié)果表明，ＺｒＯ2-ＣＦ可以有效地從多肽混合物中選擇性地萃取磷酸化多肽。
為考察方法的靈敏度，將ＺｒＯ2-ＣＦ用于β-酪蛋白酶解物中磷酸化多肽的萃取，當(dāng)β-酪蛋白的濃度低至10ｆｍｏｌ時(shí)，其酶解物經(jīng)過ＺｒＯ2-ＣＦ富集后仍然可以檢測到ｍ／ｚ3122的信號，這說明方法靈敏度高。
2．3ＺｒＯ2-ＣＦ材料對血清和牛奶中磷酸化多肽的富集應(yīng)用
由于磷酸化多肽與人類疾病有著密切關(guān)系，人血清中內(nèi)源性磷酸化多肽的測定受到越來越多的關(guān)注。由于血清樣品含有大量蛋白質(zhì)、多肽等復(fù)雜成分，對其中的磷酸化多肽進(jìn)行分析仍是一項(xiàng)挑戰(zhàn)性的工作。將血清樣品稀釋后，未經(jīng)材料富集直接進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)，如圖5ａ所示，譜圖中沒有磷酸化多肽的信號；而在經(jīng)ＺｒＯ2-ＣＦ富集后，如圖5ｂ所示，解吸液的質(zhì)譜圖中可看到4個磷酸化多肽的信號峰，它們的序列信息分別為ＤＳＧＥＧＤＦＬＡＥＧＧＧＶ（ｍ／ｚ1389.5）、ＡＤＳＧＥＧＤＦＬＡＥＧＧＧＶ（ｍ／ｚ1460.5）、ＤＳＧＥＧＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（ｍ／ｚ1545.5）和ＡＤＳＧＥＧＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（ｍ／ｚ1616.5）。
為了進(jìn)一步證明ＺｒＯ2-ＣＦ對復(fù)雜樣品中磷酸化多肽的萃取能力，將脫脂牛奶的酶解產(chǎn)物作實(shí)際樣品，繼續(xù)考察ＺｒＯ2-ＣＦ從實(shí)際樣品中捕獲磷酸化肽段的選擇性。牛奶中含有大量的蛋白質(zhì)和碳水化合物，基質(zhì)非常復(fù)雜，當(dāng)將脫脂牛奶酶解物直接經(jīng)ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ2質(zhì)譜分析時(shí)，如圖5ｃ所示，僅有6個標(biāo)示的譜峰為磷酸化多肽的信號峰，且信號較弱，譜圖中大多數(shù)是非磷酸化多肽的信號峰；然而經(jīng)過ＺｒＯ2-ＣＦ富集后，如圖5ｄ所示，非磷酸化多肽被有效去除，有9個磷酸化多肽被檢測到且信號得到極大的提高，這9個被檢測到的磷酸化肽段分別為β1（ＦＱＳＥＥＱＱＱＴＥＤＥＬＱＤＫ，ｍ／ｚ2061.5）、β2（ＦＱ-ＳＥＥＱＱＱＴＥＤＥＬＱＤＫＩＨＰＦ，ｍ／ｚ2556.8）、β3（ＲＥＬＥＥＬＮＶＰＧＥＩＶＥＳＬＳＳＳＥＥＳＩＴＲ，ｍ／ｚ3122.1）、α1（ＴＶＤＭＥＳＴＥＶＦＴＫ，ｍ／ｚ1466.3）、α2（ＴＶＤＭ-ＥＳＴＥＶＦＴＫＫ，ｍ／ｚ1594.4）、α3（ＶＰＱＬＥＩＶＰＮ-ＳＡＥＥＲ，ｍ／ｚ1660.4）、α4（ＹＬＧＥＹＬＩＶＰＮＳＡＥＥＲ，ｍ／ｚ1832.6）、α5（ＤＩＧＳＥＳＴＥＤＱＡＭＥＤＩＫ，ｍ／ｚ1927.4）、α6（ＹＫＶＰＱＬＥＩＶＰＮＳＡＥＥＲ，ｍ／ｚ1951.7）和α7（ＦＰＱＹＬＱＹＬＹＱＧＰＩＶＬＮＰＷＤＱＶＫＲ，ｍ／ｚ3024.9）。
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ＺｒＯ2-ＣＦ可以從復(fù)雜的實(shí)際樣品中高選擇性地萃取磷酸化多肽，與文獻(xiàn)報(bào)道的萃取材料相比（見表1），ＺｒＯ2-ＣＦ與其他材料對磷酸化多肽的富集靈敏度基本相當(dāng)，但是材料的制備方法及萃取方式更簡單，適用于少量樣品的磷酸化多肽的快速萃取分析。
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